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2014-06-30 1718次浏览 分类:临床前研究

王振涛1 韩丽华1  朱明军2  张淑娟2  曹生海1

(1.河南省中医院心内科  郑州4500022.河南中医学院一附院心脏中心)

摘要    目的:观察血塞通软胶囊对大鼠缺血心肌血管新生作用,并探讨其机制。方法:结扎大鼠左冠状动脉后,随机分为血塞通软胶囊组、麝香保心丸组、模型组,并设假手术组。6周后检测各组大鼠缺血心肌中微血管数(MVC)、微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血小板衍生生长因子β(PDGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF-1)蛋白的表迭及其灰度值。结果:模型组、麝香保心丸组及血塞通软胶囊组大鼠心肌梗死(MI)边缘区MVCMVD较假手术组明显增多(P<0.05);血塞通软胶囊组明显高于模型组(P<0.05),与麝香保心丸组相似(P>0.05)。模型组VEGFbFGFPDGF-pIGF-1蛋白表达及其灰度值明显高于假手术组(P<0.05);血塞通软胶囊组明显高于模型组(P<0.05),低于麝香保心丸组(P>0.05)结论:血塞通软胶囊可促进大鼠缺血心肌血管新生,其机制与促进VEGFbFGFPDGF-BIGF-1的表达有关。

关键词    血塞通软胶囊;心肌梗死;血管新生:分子机制;实验研究

中图分类号:11285文献标识码:文章编号:1008-049X(2006)03-0195-0

 

冠心病(CHD)是严重危害人类健康和引起死亡的重要疾病之一,近年来,随着冠脉搭桥、经皮腔内冠状动脉成形术、冠脉内支架植入术等的广泛应用。使部分CHD患者的临床症状和预后得以改善,死亡率呈下降趋势。但相当一部分不能进行以上治疗或发生术后再狭窄的患者。尚无解决办法,极大影响其生活质量和预后。寻找血液运行重建方法以减轻CHD患者的症状、改善心肌缺血、挽救濒危心肌是目前研究的热点,被称为心血管药物搭桥术的促血管新生疗法,正引起人们的关注。血塞通软胶囊主要成分是从中药三七中提取的三七总皂苷,现已广泛应用于临床,实验及临床研究表明该药有众多的心血管药理作用。本研究观察血塞通软胶囊对急性心肌梗死(AMI)大鼠缺血心肌血管新生的影响。并通过观察其对相关生长因子蛋白表达水平的变化探讨促血管新生机制,阐明其治疗CHD的作用机理,为指导临床合理用药提供理论依据。

1 材料与方法

1实验材料

11药物 血塞通软胶囊:昆明圣火制药有限责任公司提供,批号:20031125,将血塞通软胶囊溶于无菌蒸馏水中,每ml40mg;麝香保心丸:上海和黄药业有限公司生产,批号:A040214,将麝香保心丸粉碎后溶于无菌蒸馏水中,每ml3mg

112 试剂 小鼠抗大鼠CD34,单克隆抗体,购自美国 Santa公司,血管 内皮生长 因子 (VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板衍生生长因子β(PDGF-β)免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限责任公司,DAB显色试剂盒购自北京中山公司。

113 器材  小动物呼吸机(江西特力麻醉呼吸设备公司);显微镜(日本OLYMPUS光学有限公司);彩色病理图象分析系统(日本Sony公司)

12 动物造模及分组

选体重(20020)gWistar雄性大鼠,参照文献方法[1]1%戊巴比妥钠腹腔注射(35 mg-kg-1)麻醉后,背位固定行气管插管术,连接小动物呼吸机,人工呼吸,开胸结扎左冠脉根部,经体表心电图监测显示造成AMI后,缝合胸壁,观察大鼠生理状态平稳,停止人工呼吸,术后注射青霉素3d预防感染,成活动物随机分为血塞通软胶囊组、麝香保心丸组、模型组,假手术组手术方法同上,但在冠脉下穿线后打一松结。

1治疗方法

造模后24h内开始药物干预,qd管饲给药。血塞通软胶囊组 400 mg·kg~·d~;麝香保心丸组30 mg·kg-1·d-1;假手术组、模型组管饲与治疗组同等容积的09%氯化钠溶液l0 m1·kg-1·d-1周后处死动物。

14 观察指标

取心肌组织(包括心梗区、移行区、健存区)10%中性缓冲福尔马林液固定,石蜡包埋,制备组织切片。

14大鼠MI边缘区心肌MVCMVD测定    免疫组化法染色组织切片,一抗工作浓度为1100,染色后血管内皮细胞被染成黄、棕色。微血管判断标准按文献方法[2],不以红细胞的出现与否、是否出现管腔来计数血管,凡染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数,凡管腔大于8个红细胞大小、带有较厚肌层的血管区域血管均不计数。具体方法为:在x40视野下找到MI边缘区,然后在X400视野下进行微血管计数,每张切片随机选取5个视野,计数每个视野的 MVC,取其均值作为本例大鼠的MVC值,因MVD以毛细血管个数/视野表示,故每例MVC值即为该大鼠的MVD值。

142  大鼠Ml边缘区心肌VEGFbFGFPDGF-β、IGF-1蛋白表    检测用免疫组化法染色组织切片。兔抗鼠VEGFbFGFPDGF-β和IGF-1多克隆抗体的工作浓度均为1100,以上蛋白表达以细胞内出现棕黄色颗粒沉着为阳性反应。用病理图象分析系统计算MI边缘区心肌每X100视野中平均灰度值,每张切片随机测定6个视野,取其均值作为该大鼠的灰度值。

15  统计学方法

数据用SPSS110  For  Windows统计分析软件处理,计算所有数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较用单因素方差分析。

结果

2各组大鼠MI边缘区MVCMVD比较

各组均可看到新生的微血管(见图1)。在显微镜下计数后,结果显示:与假手术组相比,模型组、麝香保心丸组及血塞通软胶囊组MVCMVD明显增多(P<0.05);血塞通软胶囊组、麝香保心丸组MVCMVD较模型组明显增多(P<0.05)St塞通软胶囊组和麝香保心丸组作用相似(P>0.05)。见表1


光镜下,VEGFbFGFPDGFB IGF1阳性染色呈棕黄色,阳性区域主要分布于心肌细胞胞浆。

模型组4种蛋白阳性染色范围较小;假手术组正常心肌细胞中可见少量弱阳性表达,呈不规则黄褐色点状物;模型组明显多于假手术组;麝香保心丸组及血塞通软胶囊组阳性染色范围较大,4种蛋白表达明显多于模型组。灰度值见表2

模型组4种蛋白表达灰度值明显高于假手术组(P<0.05);血塞通软胶囊组、麝香保心丸组4种蛋白表达灰度值较模型组明显增高(P<0.05);血塞通软胶囊组4种蛋白表达灰度值低于麝香保心丸组,两组之间无明显差异(P>0.05)

讨论

在血管新生研究观察评价新生血管数目和侧枝循环建立情况指标中,MVD是普遍采用的能够反映血管新生强度的有效指标。目前认为CD34是较特异和敏感的生长中的血管内皮细胞表面标志,有较强的可重复性,优于内皮细胞的其他标记物[3,4],故本研究采用抗CD34单抗来检测大鼠心肌组织切片中血管新生状况,显示和计算MVCMVD。结果显示,大鼠MI边缘区CD34表达有所增强,MVCMVD明显增加,表明心肌缺血以后启动了血管新生的过程,使缺血心肌新生血管增加以改善供血。分子生物学研究表明,心肌缺血缺氧时的血管新生均是通过生长因子的作用而引起的[5]。尤以VEGFbFGF为最重要,PDGF-BIGF-1也参与了血管新生的过程。本研究发现,模型组VEGFbFGFPDGF-β,IGF-1蛋白表达及灰度值明显高于假手术组,提示缺血缺氧可诱导以上4种蛋白的表达。

血塞通软胶囊主要成分为三七总皂苷,研究表明[6,7],该药对缺血心肌有保护作用,可抗心肌缺血和再灌注损伤,扩张冠状动脉,增加冠脉血流量,改善心肌代谢等。本研究显示,血塞通软胶囊能使大鼠MI边缘区MVCMVD明显增加,与麝香保心丸作用相似,表明其有促进或诱导缺血心肌血管新生的作用。本研究还表明,应用血塞通软胶囊后大鼠缺血心肌中VEGFbFGFPDGF-β,IGF-l蛋白表达明显增加,对4种蛋白的促进作用与麝香保心丸相似。且发现4种蛋白表达水平与促血管新生的水平大体上是一致的,提示其促血管新生作用与促进VEGFbFGFPDGF-β,IGF-1表达有关。有报道,麝香保心丸有促MI后大鼠缺血心肌血管新生及促进VEGFbFGF表达的作用[8],故选该药作为对照,结果与报道相一致,而且发现其促血管新生作用还与促进PDGF-β,IGF-l表达有关。尽管血塞通软胶囊能上调4种生长因子的表达,但其机制,用药时间及最佳剂量等均有待进一步深入研究。

参考文献

1 王振涛,王硕仁,赵明镜,等.活血和益气方药对心肌梗死后左心衰大鼠左心室重构影响的比较研究[J].中国中西医结合杂志,200222(5)376-378

2 Masaharu THiroyasu IMiyako Bet a1Attenuation by genistein of sodium-chloirde-enhanced gastric carcinogenesis induced by N-Meth-yl-N-Nitro-N-Nitrosogunaidine in wistar rats[J]lnt Cancer1999803963-99

3 Tanigawa NLu CMitsui Tet a1Quantitation of sinusoidlike vessels in hepatoc ellular carcinomaIts clinical na d prognostic significance [J]Hepatol1997261216-1223

4 Kimura HNakajima TK~gawa Ket a1Angiogenesis in hepatocellular cacinoma as evaluated by CD34 immunohistochemstry[J]liver19981814-19

5 Harada KFriedman MLopez JJet a1Vascular endothelial growth factor administration in chornic myocardial ischemia[J]Am J Physiol,1996270(5Pt2)H1791

6 雷秀玲,董雪峰,李玲,等,洛泰对异丙肾上腺素诱导大鼠急性心肌缺血的保护作用[J].中国一临床药理学与治疗学,20005(2)147-150

7 蔡锡麟,张文镇.脉塞通对小鼠营养性心肌血流量的影响[J],中成药研究。1987(9)4547

8 汪姗姗 ,李勇,范维琥,等,麝香保心丸对实验性心肌梗塞大鼠心脏的促血管生成作用[J].中成药,200224(6)4464l9

(2005-11-15收稿 2005-12-19修回)

 

基金项目:“河南省杰出青年科学基金”研究项目(项目编号:O312oo22oo)

作者简介:王振涛,男,主任医师 ,医学博士。主要从事中医药防治心血管病的研究。 Tel(0371)63736064     E-mailwzht62@163com