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2014-06-30 2732次浏览 分类:临床前研究

王学颖,王阶,杨戈,刘咏梅

中国中医科学院广安门医院心内科,北京 100053

目的:观察血塞通软胶囊对大鼠心肌梗死后不同时间血流动力学及不同区域心肌细胞凋亡的影响。

方法:采用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法建立心肌梗死模型,将大鼠分为假手术组、模型组,血塞通组。治疗48h5周时,采用超声心动图监测左心室射血分数和左室短轴缩短分数,多导生理记录仪检测主动脉和左心室血流动力学改变,病理切片观察心肌病理学改变,外源性荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法检测不同区域心肌组织中的心肌细胞凋亡情况。

结果:与模型组比较,心肌梗死后各个时期,血塞通组左室短轴缩短分数均显著升高,心肌细胞凋亡指数下降(P<0.01,P<0.05)。心肌梗死后48h,血塞通组左心室收缩压、左心室压力最大上升速率有显著升高,而心脏质量指数、左心室舒张末压显著降低,与模型组比较差异有比较差异有统计学意义(P<0.01;心肌梗死后5周后,血塞通组左心室舒张压末压明显降低,左心室压力增高率明显升高与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

结论:血塞通软胶囊可能通过改善心肌梗死后功能,抑制心肌细胞凋亡从而有效治疗和预防心肌梗死后的心肌重塑个心室重构。

关键词:心肌梗死;复方;心室功能;肌细胞;心脏;细胞凋亡;大鼠

血塞通软胶囊是以三七总皂苷(Panax notoginseng saponinsPNS)为有效成分的中成药。PNS是五加科人参属多年生植物三七的主要活性成分,可活血化瘀,行气止痛,是临床上常用的治疗心脑血管疾病的中成药。药理研究证明,PNS可扩张血管,增加缺血区供血,解除冠状动脉痉挛,改善微循环,从而起到治疗冠心病的作用口]。心肌细胞凋亡是心肌梗死后尤其是非梗死区心肌细胞丢失的主要方式,梗死边缘区和非梗死区的心肌细胞凋亡是引起晚期心功能不全的重要因素]。但是,现阶段有关PNS对心肌梗死后大鼠不同部位心肌细胞凋亡的影响、对心肌重塑的影响以及起效时间方面的研究较少。本实验旨在从心肌梗死后大鼠血流动力学、心功能、病理学及心肌细胞凋亡的改变,探究血塞通软胶囊干预下的心肌梗死后不同时期血流动力学和心肌细胞凋亡的改变,为其防治心脑血管疾病提供实验佐证。

1 材料与方法

1实验材料

11实验药物及仪器 血塞通软胶囊,昆明圣火药业(集团)有限公司生产,主要成分为PNS033g/胶囊 ,批号为20O90203,批准文号为国药准字Z19990022。美国Roche公司原位细胞凋亡检测试剂盒(POD),用于脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TdTmediated dUTPbiotin nick end labelingTUNEL);惠普公司5500型超声心动图仪;成都泰盟科技有限公司BL-420F型多导生理记录仪;日本Olympus IX70型光学显微镜。

112  实验动物实验选用健康雌性W istar大鼠134只,体质量(230-4-20)g,许可证号为 SCXK()20050013,由中国中医科学院广安门医院基础研究室动物中心提供。

1实验方法

121  大鼠心肌梗死模型制备大鼠心肌梗死模型制备参照文献I。大鼠用35水合氯醛麻醉(8 mLkg),于左侧45肋间切口撕开心包,暴露心脏,轻压胸廓挤出心脏,于肺动脉圆锥及左心房间找出冠状动脉左前降支,以0号线立即结扎冠状动脉左前降支根部(肺动脉圆锥与左心耳处),将心脏送回胸腔,并挤出胸腔内血液和气体,迅速关闭胸腔,缝合皮肤,开胸时间不超过30S。局部应用青霉素8U,并给造模成活后的大鼠连续3d腹腔注射预防感染。假手术组共12只,仅置缝线而不结扎冠状动脉。冠状动脉结扎术后24h存活且心电图符合心肌梗死改变(出现梗死性Q)的大鼠作为心肌梗死模型大鼠,共78只,随机分为模型组和血塞通组。分组后随即进行灌胃,血塞通组予血塞通软胶囊灌胃,用无菌蒸馏水混合灌胃,剂量按照PNS的含量计算为400mgkg[I1],每天1次;模型组采用生理盐水灌胃,剂量为10mLkg。各组再按观察时点(48h5)随机分为两个亚组。实验过程中由于大鼠心肌梗死造模术后心力衰竭以及实验进程中麻醉等原因,中途意外死亡13只,最终纳入大鼠共77只,心肌梗死5周时39只,其中假手术组6只,模型组16只,血塞通组l7只;心肌梗死48h38只,其中假手术组6只,模型组17只,血塞通组15只。

12心脏超声心动图    分别于结扎冠状动脉48h5周时,称取大鼠体质量,腹腔注射麻醉,左胸前部剃毛,采用超声心动图仪检测搏出量占心室舒张末期容积的百分比,即左室射血分数(ejection fractionEF)、左室短轴缩短分数(fractional shorteningFS)。每一数据均测量3次,取其均值。

123    血流动力学检测    采用BI-420F型多导生理记录仪检测。大鼠经腹腔麻醉后,背位固定于鼠台,分离右颈总动脉,插入充满肝素生理盐水的导管,稳定10 min后,记录大鼠心率(heart rateHR),升主动脉收缩压(aortic systolic pressureASP)、舒张压(aortic diastolic pressureADP);将导管进一步插入左心室,记录左心室收缩压(1eft ventricular systolic pressureLVSP),左心室舒张末压(1eft ventricular end-diastolic pressureLVEDP),左心室内压最大上升速率(maximum rate of left ventricular pressure rise+dpdt)和左心室内压最大下降速率(maximum rate of left ventricular pressure fall-dpdt),观察其血流动力学变化。

12心肌组织切片制备    分别于术后48h5周,检测血流动力学改变和心脏B超后处死,取出并分离心脏,剔除血管和心耳,生理盐水洗净,滤纸吸干城区质量,计算心脏质量指数。心脏质量指数(ratio of heart to body weight ,HW/BW ratio=全心质量/体质量。垂直于心脏左室长轴,将左室从心尖至心底平分为三等分,在中等分最大直径处切取约3mm组织,4%甲醛固定,石蜡包埋,5μm石蜡切片,HE染色后光学显微镜下进行组织病理学观察。

1.2.5    TUNEL染色检测心肌细胞凋亡    切取心肌梗死区/瘢痕区(infarcted/scar area)、非梗死区(non-infarcted/scar area)、边缘区(border area)组织分别行常规石蜡包埋,制成5μm的组织切片。外源性荧光标记的TUNEL检测心肌细胞凋亡情况[4],棕黄色或棕褐色细胞核为凋亡细胞,蓝紫色为非凋亡细胞,阴性对照片无棕黄色着色。光学显微镜下(×200)观察并摄片,在梗死区、瘢痕区、梗死边缘区和非梗死边缘区分别随机选择5个视野,以细胞核周围确认有肌纤维为阳性细胞,以TUNEL染色的凋亡细胞为阳性细胞,检测阳性表达率(阳性核占视野中总细胞核百分比)作为细胞凋亡指数。

1.2.6    DNA阶梯检测心肌细胞凋亡    同时取各个区域剩余标本抽提得到的DNA1%琼脂糖凝胶电泳分析。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶染色,在紫外光下至少可以检出1~10ngDNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。如果细胞发生凋亡,即可以观察到典型的DNA阶梯(DNA ladder)。

1.3    统计学方法    数据采用spss 11.0 进行统计学处理。如资料呈正态分布,且方差整齐,数据用`x±s表示,多个样本均数的比较用方差分析,两样本均数的比较用q检验;非正态分布资料,数据用中位数(M)和四分位数中Q25Q75表示,采用非参数检验进行多组间比较,组间两两比较采用秩和检验。检验水准α=0.05

2.结果

2.1    HE染色检测大鼠心脏组织病理学改变    假手术组心肌组织细胞平排列整齐,纤维走行一致,心肌心包核清楚。结扎冠状动脉后48h,模型组梗死区心肌细胞肌质溶解呈网状,并有散在的微血管出现,细胞间可见红细胞,病灶内伴有大量的炎性细胞和单个核细胞浸润;部分心肌细胞坏死,结构消失,核溶解,出现肌凝现象,肌原纤维融合成均质红染物;心内膜侧仍见大量的存活心肌细胞;心肌细胞坏死范围与正常组织界限不清。心肌梗死5周后,梗死区心肌细胞、炎性细胞消失,成纤维细胞、内皮细胞增多;坏死区域扩大,形成瘢痕去;梗死边缘区心肌细胞坏死范围与正常组织界限不清。血塞通干预后48h,梗死区和边缘区细胞坏死数量较模型组减少;心肌细胞坏死,但仍保持细胞轮廓;细胞核固缩或碎裂,肌质少量凝聚,炎性细胞数量较模型组明显减少;梗死边缘区有大量微血管出现。血塞通干预5周后,梗死区散在心肌细胞,炎性细胞消失,成纤细胞、内皮细胞略有增多;坏死区域扩大及形成的瘢痕区较模型组小;梗死边缘区与正常组织界限较48h清晰。见图1



2.2    血塞通软胶囊干预不同时间对心肌梗死大鼠心脏质量指数的影响    心肌梗死后48h后,模型组心脏质量指数与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.01;血塞通组与模型组比较,心脏质量指数明显降低(P<0.01)。心肌梗死5周后,模型组心脏质量指数与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.01),血塞通组与模型组比较,差异无统计学意义。该结果提示血塞通软胶囊具有一定的抑制心肌肥厚的作用。见表1


2.3    血塞通软胶囊干预不同时间对心肌梗死大鼠血流动力学的影响   心肌梗死48h,与假手术组比较,模型组和血塞通HRASPADP下降,但差异无统计学意义(P>0.05);模型组LVSP+dp/dt-dp/dt值较假手术组明显下降(P<0.01,LVEDP较假手术组升高(P<0.01;与模型组比较,血塞通组LVSP+dpdt显著升高(P<005P<001)LVEDP显著降低(P<0.01)-dpdt值与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。心肌梗死5周时,与假手术组比较,模型组的HR显著升高(P<0.05),模型组和血塞通组SBPDBPLVSP的值虽有升高,但差异无统计学意义(P>0.05),模型组LVEDP值较假手术组明显升高(P<0.01),而+dpdt-dpdt值明显降低(P<0.01)。血塞通组与模型组比较,LVEDP值明显降低(P<0.01)+dpdt-dpdt值明显升高(P<0.01)。见表2和表3




2.4       血塞通软胶囊干预不同时间对心肌梗死大鼠心功能的影响    无论是在心肌梗死初期(48h)还是在心肌梗死后期(5),与假手术组相比,模型组和血塞通组EFFS均显著降低(P<0.01);与模型组比较,血塞通组EFFS均显著升高(P<0.01)。见表4

2.5    血塞通软胶囊干预不同时间对大鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡后影响    心肌梗死初期(48h),与假手术组比较,模型组和血塞通组在梗死区(缺血区)、边缘区及非梗死区均有大量凋亡的心肌细胞出现(P<0.01)而血塞通组大鼠不同部位的心肌细胞凋亡指数较模型组明显减少,差异具有统计学意义(P<0.01)心肌梗死后期(5周),与假手术组比较,模型组和血塞通组仍然在梗死区(缺血区)、边缘区及非梗死区均有大量的心肌细胞凋亡出现(P<0.01,但比较心肌梗死初期减少。血塞通组大鼠不同部位的心肌细胞凋亡指数低于模型组,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表5



DNA凝胶电泳提示,心肌梗死后48h5周,大部分梗死心脏标本DNA凝胶电泳图呈现典型的DNA梯带,而假手术祖DNA梯带阳性率接近于0。见图2和图3




3.讨论

本实验动物心肌梗死模型的制备方法已十分完善,通过后期心电图出现Q波进行判定,符合心肌梗死模型要求。由于心肌梗死后易出现心室重构和心肌重塑,有效预防心肌重塑,改善心室重构成为了临床用药治疗冠心病心梗的核心目的之一。心室重构是心脏在心肌梗死后的一种代偿性现象,可以体现在血流动力学的改变上[5]。因此,可以通过血流动力学的改变及心功能指标的变化观察心脏的心室重构能力从而判定心肌梗死后左室功能的改变;而心肌梗死后的心室重塑过程则是梗死区心肌坏死膨出、非梗死区心肌肥大、间质纤维化等一系列心室在结构和功能上的变化。由于心肌细胞凋亡是心室重塑过程中重要的病理基础之一[6],有效阻止心肌梗死后心室壁心肌细胞的凋亡,可以有效减轻心肌梗死后心肌重塑的发生。

三七总皂苷为血塞通软胶囊的主要成分,研究表明,该药对缺血心肌有保护作用,可抗心肌缺血和再灌注损伤,扩张冠状动脉,增加冠脉血流量,改善心肌代谢[7]。本实验结果显示,模型组大鼠心肌梗死后主要是±dpdt明显下降,心脏质量指数和LVEDP明显升高;心肌梗死后由于坏死心肌收缩力丧失,直接影响心排血功能,EFFS明显降低,说明心肌梗死后心脏收缩和舒张功能明显受损,心室重构明显。而血塞通组无论在心肌梗死初期(48h)还是后期(5)EFFS,±dpdtLVEDPLVSP等与模型组比较,差异均有统计学意义,结合HE染色与心脏质量指数的比较,提示在大鼠心肌梗死初期(48h)血塞通软胶囊可减轻心脏负荷,改善左室功能,减少初期心肌代偿性增厚,并且长期用药后也可见心肌组织增生减缓,可以有效降低心室重构的程度。心肌梗死后不同时期大鼠均出现了明显的心肌细胞凋亡,血塞通软胶囊在心肌梗死不同时期对整个心脏各个不同部位的心肌细胞凋亡都有一定的抑制作用,用药时间越长,对心肌细胞凋亡的抑制作用越明显,说明血塞通软胶囊是通过早期有效抑制心肌细胞凋亡,从而抑制心肌重塑和心室重构的发生发展,以达到有效治疗目的的。

虽然本实验不可避免地出现了心肌梗死后心力衰竭,造成实验样本量减少,但是其余完整样本数据反映的疗效仍然显示血塞通作为治疗心血管疾病常用药物的优势和功效,同时为其防治心脑血管疾病提供了有力的实验佐证。

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基金项目:国家自然科学基金项目(No:30672765

Correspondencde: Jie ,MD ,Professor;  TEL010-88001238;  Email: wangjie0103@yahoo.com.cn