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2014-06-19 1267次浏览 分类:文献资料


吴坤,潘强,杨珺,丁桥兰

(军事医学科学院附属医院药剂科,北京100039)

中图分类号:R965  文献标识码:文章编号:1006-4931(2005)01-0031-02

摘要  目的:研究黄藤乙醇提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞的抑制作用。方法:体外培养烧伤后的人增生性瘢痕成纤维细胞,加入不同浓度的黄藤提取物,24 h后观察细胞形态学,以乳酸脱氢酶(LDH)为指标观察细胞毒性,用MTr法检测其增殖活性。结果:不同浓度的黄

藤醇提取物均能改变成纤维细胞形态,抑制细胞增殖,浓度在300~μgmL以下无明显的细胞毒作用。结论:黄藤醇提取物对人增生性瘢痕成纤维细胞具有抑制作用,并呈剂量依赖关系。

关键词 烧伤;增生性瘢痕;成纤维细胞;黄藤

增生性瘢痕(Hypertorphic scasrHS)是烧伤、创伤愈合后所遗留的皮肤异常病变,也是真皮纤维化的一种形式,其防治尚无有效方法。黄藤 (Fibaurea recisa Piere)为防己科天仙藤属植物,有消肿、解毒、清热、利湿功效,主要含有掌叶防己碱、药根碱、黄藤内酯、伪非洲防己碱等有效成分,传统中医外用于治疗痈疽肿毒、顽癣恶疮 ,因此将其醇提物进行人增生的研究,考察其对增生性瘢痕是否有治疗作用。 

1         材料与方法 

1. 1  材料 

黄藤(北京琪景堂医药公司);黄藤醇提物(黄藤生药500 g,用60 的乙醇冷浸24 h,旋转蒸发仪浓缩至干,密封于灭菌安瓿备用)。细胞培养基(DMEM)、胰蛋白酶(美国Gibco公司);胎牛血清(中国天津血清厂)MTr(美国 Sigma公司);二甲基亚砜(DMSO,美国进口分装)

1.2          方法

1.2.1  细胞培养

手术中取下的增生性瘢痕组织(患者年龄130岁,病程半年至2),在无菌培养皿中漂洗,去除血污及脂肪,剪碎成约1 mm的小块,培养于含胎牛血清10%,100 IUL青霉素、100  μgL链霉素的DMEM培养液中,置37CO2培养箱中培养。细胞长成致密单层后,用2.5 gL胰蛋白酶消化,以 13传代,将第 39代细胞用于试验。

1.2.2  乳酸脱氢酶(LDH)测定

取对数生长期的细胞,以l05个/mL细胞浓度接种于24孔培养板培养,每孔接种 500 μL,置CO2箱培养7 d。每3 d换液1次。将条件培养基分为试验组(AF组,加500 L黄藤乙醇提取物,浓度分别为600300l507537.5l8.75 μgmL)和对照组加500μL DMEM),继续培养24 h,取上清液,用全自动生化分析仪测定 LDH活性值。

1.2.3  细胞形态学观察

取对数生长期的细胞,以 l05个/mL细胞浓度接种于24孔培养板培养,每孔接种500μL。置 CO2箱培养8h后,分为试验组(500 L黄藤乙醇提取物,浓度为300μgmL)和对照组(500μLDMEM),继续培养24 h,于倒置显微镜下观察、照相。

1.2.4  MTT比色法测定细胞增殖状况

取对数生长期的细胞,以 l05个/mL细胞浓度接种于96孔培养板培养,每孔接种100μL100μL培养液,置CO2箱培养12 h,吸弃上清液,按分组加条件培养液(浓度分别为3001507537.518.759.370 μgmL)200 L,继续培养24 h,吸弃上清液l0μL,加5gLMTT10 L/孔继续培养4 h,吸弃上清液,每孔加 DMSO 200μL,不时振荡显色,以自动酶联免疫分析仪测定吸光度A(波长 492 mm),计算抑制率。抑制率 =(1-试验组吸光度均值/对照组吸光度均值)×100

结果

2.1  黄藤乙醇提取物对人瘢痕成纤维细胞的毒性作用

加入黄藤乙醇提取物作用24 h后培养上清液中LDH活性,对照组与试验组(AE)无显著性差异(P>0.05),与 F组有极显著差 (P<0.01)。说明药物浓度在 600 μgmL时对细胞产生毒性作用,浓度在 300 ggmL及以下无细胞毒作用 (见表 1)

l 乳酸脱氢酶的活性测定结果( n=3,`X±δ)

组别

药物浓度(μg/ml

测定值(U/L

对照组

0

25.3±4.2

A

18.75

28.4±3.6

B

37.5

28.8±3.2

C

75

29.6±3.8

D

150

31.5±4.3

E

300

34.2±3.6

F

600

72.5±5.2

 

 

2.2  黄藤乙醇提取物对人瘢痕成纤维细胞形态学的影响

成纤维细胞在用药前伸展良好,折光性较弱,有方向性、呈放射状 ;而加黄藤乙醇提取物24 h后,成纤维细胞数目减少,形状变得不规则,突起变短,细胞排列混乱,细胞内代谢产物增多。

2.3  黄藤乙醇提取物对人瘢痕成纤维细胞增殖的影响

M1Tr比色法测定结果显示,黄藤对增生性瘢痕成纤维细胞生长增殖呈剂量依赖性抑制,细胞增殖减慢(见图1)


增生性瘢痕是皮肤真皮损伤后局部结缔组织增生而形成的病理结构,它是创伤尤其是烧伤后常见的并发症。现代细胞生物学和分子生物学的研究认为,成纤维细胞的大量增殖与凋亡抑制,以及细胞外基质中胶原合成与降解失衡,部分细胞因子的大量产生构成了增生性瘢痕的生物学基础,并且其有一定的血管依赖性。目前I临床治疗增生性瘢痕的方法主要分为手术治疗和非手术治疗。非手术治疗包括药物治疗、放射治疗、激光治疗、冷冻治疗、生物活性 因子治疗、压迫治疗、基因治疗等。尽管长期I临床经验的积累和众多研究在增生性瘢痕发生机制及防治方面已经取得了巨大成就,但时至今日还没有十分令人满意的、特别有效的防治策略,亦未发现一种对不同部位、面积、病程的增生性瘢痕都有效而又可靠的药物及制剂。因此研制理想的增生性瘢痕治疗药物及制剂有待于我们进一步的努力。

中药对增生性瘢痕的防治有着久远的历史 ,对其发生机制也有独特的认识,认为它主要由气血壅滞、经络痹阻、痰湿搏结或三者相辅而成所致,治疗上主要是活血化瘀、软坚散结为主。因此从中药中研制出一种高效、低毒的药物及制剂,将给众多痛苦的增生性瘢痕患者带来福音。从本试验结果来看,药物浓度在37.5~gmL时,黄藤乙醇提取物对成纤维细胞生长的抑制率已超过50%,效果显著,但是其作用机理还有待于进一步研究。

成纤维细胞的增殖是通过细胞有丝分裂实现的,每个细胞周期可分为分裂期(M)和间期 (包括 G1SG2,),暂时不进行分裂增殖的细胞称为G0期细胞。成纤维细胞的增殖受多种环境因素的影响,其中最重要的已知因素为生长因子。生长因子调控细胞分裂增殖与 G0G1期有关。有试验提示:在G1期中间存在一个细胞分裂的限制点,G1期细胞停留在限制点内则处于休止状态,一旦越过限制点就进入增殖状态。而许多生长因子,包括血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)及胰岛素样生长因子(IGF)都可促使 G0G1期细胞跨越限制点,开始分裂增殖。这种作用通常分为两类:PDGFFGF等推动 G0G1,期细胞进入分裂前的感受态,所以称感受因子,而EGFTGF-α,IGF-1等促使感受细胞进一步发展向S期过渡,所以称作增进因子。感受因子和增进因子共同作用的结果就是推动细胞通过限制点进入S期,进而完成整个细胞周期。黄藤乙醇提取物究竟作用于细胞分裂增殖的哪一期,以及抑制哪种生长因子还需进一步试验证明。

参考文献:

1】黄泰康,丁志遵,赵守训,等 、现代本草纲 目【M.北京:中国医药科技出版社.20002 4472 448.

2】鄂征.组织培养和分子细胞学【M】.北京:北京出版社,1995160.

3】付小兵,王德文.现代创伤修复 学【M.北京:解放军医学出版社,19998990

4】李芸元,鲁开化,郭树忠.新编瘢痕学【M】.上海:第四军 医大学出版社.2003298

(收稿日期:211040329;修回 日期:211040618)